En el contexto de la epidemia de Covid-19 se ha polemizado mucho sobre si es posible o no usar nanopartículas de óxido de grafeno en vacunas en general. Y aunque se ha demostrado que la toxicidad de las vacunas Covid-19 en realidad se debe a la proteína espiga que daña las células endoteliales, también es verdad que un estudio de la Universidad Estatal de Georgia y de la Universidad de Emory ha confirmado el uso de nanopartículas de óxido de grafeno en una nueva vacuna intranasal contra la gripe, con el objetivo de “mejorar la inmunidad in vitro e in vivo”. Por lo que la idea de que esa sustancia pudiera estar presente en alguna otra vacuna experimental no resulta descabellada.
Por Graphene-Info
Investigadores de la Universidad Estatal de Georgia y de la Universidad de Emory han desarrollado una vacuna intranasal contra la gripe utilizando hemaglutinina (HA) recombinante, una proteína que se encuentra en la superficie de los virus de la gripe, como componente antigénico de la vacuna.
También crearon un nanomaterial bidimensional (nanopartículas de óxido de grafeno funcionalizadas con polietileno) y descubrieron que mostraba potentes efectos adyuvantes (de mejora de la inmunidad) en las vacunas contra la gripe administradas por vía intranasal.
“En nuestro estudio, informamos por primera vez de que los nanomateriales de óxido de grafeno bidimensionales tenían un potente efecto adyuvante en el refuerzo de las respuestas inmunitarias de las vacunas intranasales de hemaglutinina (HA)”, dijo el Dr. Chunhong Dong, autor principal del estudio y becario de investigación postdoctoral en el laboratorio del Dr. Baozhong Wang en el Instituto de Ciencias Biomédicas.
“Este estudio aporta nuevos conocimientos sobre el desarrollo de sistemas de vacunas intranasales de alto rendimiento con nanopartículas bidimensionales en forma de lámina”, dijo Dong. “Las nanopartículas de óxido de grafeno tienen atributos extraordinarios para la administración de fármacos o el desarrollo de vacunas, como la superficie ultra grande para la carga de antígenos de alta densidad, y la vacuna mostró propiedades superiores de mejora de la inmunidad in vitro e in vivo. La nanoplataforma podría adaptarse fácilmente a la construcción de vacunas para la mucosa contra diferentes patógenos respiratorios”.
El estudio, realizado en ratones y en cultivos celulares, descubrió que las nanopartículas mejoraban significativamente las respuestas inmunitarias en las superficies de las mucosas y en todo el cuerpo de los ratones. Las sólidas respuestas inmunitarias conferían protección inmunitaria contra los desafíos del virus de la gripe por cepas de virus homólogas (iguales) y heterólogas (diferentes).
Los resultados también son prometedores, ya que las vacunas antigripales intranasales sin aguja presentan ventajas logísticas superiores a las vacunas inyectables tradicionales, como la facilidad de administración con gran aceptación por parte de los receptores y la evitación de residuos de riesgo biológico.
Significado
Una vacuna contra la influenza intranasal (in) no invasiva puede inducir respuestas inmunitarias de las mucosas en las vías respiratorias, previniendo la infección en la puerta de entrada del virus. Sin embargo, la ausencia de adyuvantes de mucosas apropiados en la actualidad dificulta el desarrollo de dicha vacuna. Aquí, desarrollamos nanopartículas de óxido de grafeno bidimensionales funcionalizadas con polietilenimina (GP) que mostraban altas capacidades de carga de antígenos y propiedades superiores de inmunopotenciación. Se indujeron respuestas inmunitarias robustas y ampliamente reactivas en la inmunización con nanopartículas de GP-HA, lo que confiere protección contra virus homólogos y heterólogos. Con versatilidad y flexibilidad, las nanopartículas GP se pueden adaptar fácilmente para construir vacunas mucosas de diferentes patógenos respiratorios.
Abstracto
La (in) inmunización intranasal es una vía de vacunación prometedora para enfermedades respiratorias infecciosas como la influenza. Las vacunas de proteínas recombinantes pueden superar los problemas de seguridad y la larga fase de producción de las vacunas contra la influenza basadas en virus. Sin embargo, las vacunas de proteínas solubles son poco inmunogénicas si se administran por vía intravenosa. Aquí, informamos que las nanopartículas de óxido de grafeno funcionalizadas con polietilenimina (nanopartículas GP) mostraron altas capacidades de carga de antígenos y propiedades superiores de inmunopotenciación. Mediante un sencillo enfoque de adsorción electrostática, se incorporó hemaglutinina (HA) de la influenza en nanopartículas de GP y se mantuvo la integridad estructural y la antigenicidad. Las nanopartículas de GP resultantes mejoraron la internalización de antígenos y promovieron la producción de citocinas inflamatorias y la maduración de las células dendríticas JAWS II. Comparado con HA soluble, Las formulaciones de nanopartículas de GP indujeron respuestas inmunes significativamente mejoradas y de reactividad cruzada tanto en sitios sistémicos como en superficies mucosas en ratones después de la inmunización. En ausencia de cualquier adyuvante adicional, la nanopartícula de GP potenció significativamente las respuestas inmunes humorales y celulares específicas de antígeno, comparable al reconocido inmunomodulador de mucosas potente CpG. Las robustas respuestas inmunes conferían protección inmunitaria contra los desafíos de virus homólogos y heterólogos. Además, el efecto autoadyuvante sólido de las nanopartículas de GP puede enmascarar el papel de CpG cuando se combinan. En ausencia de adyuvantes de mucosas aprobados actualmente, las nanopartículas de GP pueden convertirse en potentes en las vacunas contra la influenza, proporcionando una amplia protección. Con versatilidad y flexibilidad,
La influenza sigue siendo una de las principales enfermedades infecciosas que causan morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La vacunación es el método más rentable para prevenir la infección por el virus de la influenza. Sin embargo, las vacunas actuales contra la influenza estacional basadas en virus inducen inmunidad específica a la cepa y son menos efectivas contra cepas no coincidentes que pueden causar epidemias de influenza ( 1). Además, no existe una contramedida de vacuna disponible para las nuevas cepas pandémicas. La (in) inmunización intranasal es una vía de vacunación prometedora para las enfermedades respiratorias infecciosas, como la influenza. Esta vía de vacunación puede inducir respuestas inmunitarias tanto sistémicas como mucosas. La inmunoglobulina A secretora (sIgA) y la inmunoglobulina G (IgG) pueden prevenir la infección por influenza en la puerta de entrada del virus. Se ha informado que la inmunidad de la mucosa de la influenza confiere protección cruzada contra virus heterólogos y heterosubtípicos ( 2 ). Además, las vacunas contra la influenza sin agujas poseen ventajas logísticas superiores sobre las vacunas inyectables tradicionales, como una fácil administración con una alta aceptación para los receptores y la evitación de desechos de objetos punzantes biopeligrosos.
Sin embargo, el desarrollo de vacunas antigripales ha progresado lentamente. La vacuna contra el virus de la influenza atenuada en vivo adaptada al frío (LAIV) es la única vacuna humana contra la influenza disponible hasta la fecha. Los estudios han demostrado que la vacuna LAIV podría proporcionar inmunidad heteróloga ( 3 ). No obstante, surgen preocupaciones sobre la seguridad de la LAIV, especialmente en poblaciones de alto riesgo, como los bebés menores de 2 años y los ancianos mayores de 50. La LAIV podría sufrir reordenamientos genéticos y revertir a una forma virulenta, lo que representa un riesgo. Además, se informó sobre la eficacia protectora subóptima de las vacunas LAIV en niños durante la pandemia H1N1 2009. Se necesita urgentemente una nueva generación de vacunas contra la influenza, seguras, eficientes e independientes del virus que induzcan una protección cruzada más amplia con alta eficacia.
La vacunación intranasal con vacunas basadas en proteínas / péptidos recombinantes es una estrategia atractiva con alta seguridad ( 4 ). Los antígenos de proteínas / péptidos purificados eliminan los problemas de seguridad en las personas con alergia al huevo, poseen efectos secundarios mínimos y permiten una producción rápida y rentable. Sin embargo, las vacunas de proteínas solubles son poco inmunogénicas en la inmunización debido al entorno mucoso duro y tolerogénico ( 5 ). La selección de formulaciones y adyuvantes apropiados es crucial para el éxito de las vacunas. Las plataformas de vacunas de nanopartículas se han solicitado en el desarrollo de vacunas en los últimos años ( 6 , 7). Las nanopartículas sirven como portadores de antígenos y adyuvantes e inmunoestimulantes en sí mismos para mejorar las respuestas inmunes. Se han informado los efectos inmunoestimulantes de varias nanopartículas ( 8 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 13 ). Sin embargo, la mayoría de las vacunas de nanopartículas adolecen de una baja capacidad de carga de antígenos, procedimientos de preparación complicados y prolongados y complejidad estructural debido a la conjugación covalente.
Las nanopartículas de óxido de grafeno (GO) bidimensionales (2D) tienen un gran potencial como plataforma de vacuna novedosa debido a sus extraordinarios atributos. Estas características incluyen la relación de aspecto alta y el área de superficie ultragrande para la asociación de antígenos de alta densidad, grupos químicos ricos para la modificación de la superficie flexible y la carga de antígenos no covalentes mediante adsorción electrostática, enlace de hidrógeno e interacciones de apilamiento π – π e hidrófobas. Además, las nanopartículas de GO en sí mismas son biocompatibles y no inmunogénicas ( 14 , 15 ). Se demostró que varias formulaciones de la vacuna GO inducen una mejor respuesta inmunitaria activando las células inmunitarias o activando la señalización innata ( 16 ⇓ - 18). Sin embargo, la mayoría de los estudios anteriores se limitaron a rutas convencionales con antígenos tumorales para inmunoterapias contra el cáncer. Faltan estudios sobre la influenza basada en GO en las vacunas.
Desarrollamos una nanoplataforma de vacuna contra la influenza GO (GO-PEI, GP) funcionalizada con polietilenimina (PEI), preparamos nanopartículas de influenza GP mediante la incorporación de hemaglutinina (HA) de influenza recombinante e investigamos sus efectos inmunopotenciadores ( Fig. 1 ). Nuestro trabajo reveló que las nanopartículas de gripe GP mejoraron la internalización de antígenos y promovieron la producción de citocinas inflamatorias y la maduración de las células dendríticas (DC) JAWS II durante experimentos in vitro. en la vacunación con nanopartículas de gripe GP indujeron fuertes respuestas inmunitarias humorales y celulares, lo que confiere una protección más amplia contra los desafíos de los virus de la gripe homólogos y heterólogos en ratones.
Ilustración esquemática de la preparación y el rendimiento de nanopartículas de gripe GP. ( A ) Preparación de nanopartículas GP y GP-HA / adyuvante. ( B ) Efectos inmunoestimulantes de las vacunas de nanopartículas GP. Las vacunas de nanopartículas GP mostraron una captación celular mejorada en las CD y promovieron la secreción de citocinas inflamatorias y la maduración de las CD. en la vacunación con nanopartículas de gripe GP indujo una protección inmunológica amplia y significativamente mejorada contra los desafíos del virus de la gripe homo- y heterólogos. CTL, linfocito T citotóxico; SR: tasa de supervivencia.
Resultados
Fabricación y caracterización de vacunas de nanopartículas GO.
Las vacunas de nanopartículas GO se pueden preparar en varios enfoques ( 19 , 20 ). Descubrimos que las mezclas simples de GO desnudos y proteínas son propensas a la precipitación, y la capacidad de carga de proteínas es baja por adsorción superficial directa. Una de las mejores formas de diseñar sistemas de administración de vacunas basados en GO es la funcionalización de la superficie, que adapta las interacciones entre las nanopartículas de GO, los componentes de la vacuna y las biosuperficies y ajusta la actividad adyuvante. En este estudio, funcionalizamos GO con un polímero catiónico, PEI ramificado, para construir nanopartículas de GP e investigamos sus efectos de mejora inmunológica ( Fig. 1 ). Las nanopartículas cargadas positivamente son especialmente adecuadas para la vacunación de las mucosas ( 21). Estudios recientes demostraron que la PEI tiene un potente efecto adyuvante en las mucosas ( 22 ).
Las nanopartículas de GO prístinas se prepararon mediante sonicación de punta de escamas de GO en un baño de hielo. Las escamas de GO se convirtieron gradualmente en nanopartículas de GO de tamaño nanométrico más pequeñas tras la sonicación ( Apéndice SI , Fig. S1 A ), y las nanopartículas finales tenían alrededor de 164 nm. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM) revelaron la morfología en forma de hoja y la distribución uniforme del tamaño de las nanopartículas GO ( Fig. 2 A y Apéndice SI , Fig. S1 B ). Preparamos nanopartículas de GP utilizando el método de acoplamiento de carbodiimida. El análisis termogravimétrico (TGA) indicó que el 17,94% de PEI se conjugó en las nanopartículas de GP ( Apéndice SI , Fig. S1 C). Las nanopartículas de GP resultantes eran de 185 ± 1,94 nm ( Fig. 2 C ). De GO prístino a GP positivo, la carga superficial cambió de negativo (-38.5 ± 0.51 mV) a positivo (66.97 ± 1.65 mV) ( Fig.2 D ), facilitando una alta capacidad de carga de los antígenos proteicos por adsorción electrostática directa sin químicos. conjugación. En particular, en comparación con las nanopartículas GO, GP ha mejorado la dispersabilidad y la estabilidad en soluciones salinas. Se informó que la GO funcionalizada con PEI era biocompatible ( 23 ).
Caracterización de las nanopartículas de gripe GP. ( A ) Imagen TEM de nanopartículas GO. ( B ) Análisis de tinción con azul de Coomassie (CB) y transferencia Western (WB). ( C y D ) Tamaño de nanopartículas y análisis de potencial zeta. ( E ) Internalización del antígeno en las CD de JAWS II por inmunofluorescencia. El H3 intracelular se sondeó mediante anticuerpos marcados con fluorescencia (rojo). ( F - H ) Producción de citocinas proinflamatorias de células JAWS II tratadas con diferentes formulaciones a las concentraciones de H3 indicadas. ( Yo y j) Expresión de CD86 en células JAWS II mediante citometría de flujo. MFI, intensidad de fluorescencia media. Los datos se presentan como media ± SEM. La significación estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunnett, comparando la media de cada grupo con la media del grupo de control (sin tratar) (* P <0,05; ** P <0,01; *** P < 0,001; **** P <0,0001; ns no representa significación, P > 0,05).
Hemos demostrado previamente que la HA de influenza trimétrica estabilizada con GCN4 posee una inmunogenicidad mejorada en comparación con la HA monomérica ( 24 ). Purificamos Aichi HA trimérico recombinante (A / Aichi / 2/1968 (Aic), H3N2, designado H3) con alta pureza, según lo determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) seguida de tinción con azul de Coomassie ( Fig. 2 B ). La retención de la antigenicidad de HA se verificó mediante análisis de transferencia Western con anticuerpos. El estado trimérico de H3 se determinó mediante entrecruzamiento de bis [sulfosuccinimidil] suberato (BS3), seguido de transferencias Western ( Apéndice SI , Fig. S2 A). Se observó una banda principal con un peso molecular triple del HA monomérico después de un tratamiento de alta concentración de BS3 (> 5 mM) para fijar el HA polimérico, lo que indica el estado trimérico dominante del H3 purificado.
Hemos generado formulaciones de vacunas de nanopartículas de GP por un simple enfoque de mezcla / adsorción, como se esquematiza en la Fig. 1 A . H3 se unió a la gran superficie de las nanopartículas de GP principalmente a través de interacciones electrostáticas. La capacidad de carga de antígeno de las nanopartículas de GP se evaluó mediante SDS-PAGE. En proporciones más altas de GP a H3 (2: 1, 1: 1 y 1: 2), había fuertes bandas de H3 de las nanopartículas sin señales visibles de los sobrenadantes ( Apéndice SI , Fig. S2 B), lo que indica la estrecha unión de H3 sobre las nanopartículas de GP. Algo de H3 libre estaba presente en los sobrenadantes de relaciones GP: H3 más bajas, lo que indica una cantidad excesiva de H3 en esta circunstancia. Las nanopartículas de GP-H3 resultantes tenían una fuerte estabilidad coloidal, especialmente a proporciones de GP: H3 más altas. El análisis de espectros de absorción ultravioleta-visible (UV-Vis) en el Apéndice SI , Fig. S2 C confirmó aún más la fuerte unión de H3 en nanopartículas de GP. Los resultados demostraron que las nanopartículas de GP con cargas positivas y áreas de superficie ultragrandes podrían servir como portadores de antígenos proteicos con altas capacidades de carga de antígenos.
CpG ODN es un potente inmunomodulador de la mucosa para la inducción de inmunidad mediada por células específicas de antígeno y respuestas inmunes humorales. Usamos CpG ODN1826 como grupo de control positivo en nuestro trabajo. Mientras tanto, las moléculas CpG cargadas negativamente podrían colocarse fácilmente con influenza HA sobre las partículas GP para generar nanopartículas con adyuvante. Se empleó electroforesis en gel de agarosa para investigar si todos los CpG de alimentación formaban complejos y se cargaban en las nanopartículas de GP. Como se muestra en el Apéndice SI , Fig. S2 D, se observaron fuertes señales de CpG de CpG libre y H3 + CpG pero no de los sobrenadantes de GP-H3 / CpG (10: 5: 1) y GP-H3 / CpG (10: 5: 2.5). Los resultados indicaron que todo el CpG de alimentación se colocó con H3 en las nanopartículas de GP a través de la interacción de adsorción electrostática. Además, las nanopartículas de GP-H3 / CpG (10: 5: 1) obtenidas mostraron un valor de potencial Zeta de 32,83 ± 0,49 mV ( Fig.2 D ), lo que indicó que las nanopartículas resultantes retuvieron cargas positivas después de cargar con H3 y CpG . Para estudios posteriores, se utilizó una relación GP: H3: CpG de 10: 5: 1 para fabricar nanopartículas de vacuna GP. Las nanopartículas de GP-H3 y GP-H3 / CpG resultantes tenían un diámetro de 170 a 200 nm ( Fig.2 C ) y exhibían potenciales Zeta de> +30 mV ( Fig.2D ). Los resultados demostraron que las nanopartículas de vacuna H3 basadas en GP podrían generarse mediante el método de mezcla fácil con características de partículas apreciables para la inmunización.
Efectos sobre la línea DC murina JAWS II.
La captación eficaz de antígenos por las CD es fundamental para inducir potentes respuestas inmunitarias. Detectamos la internalización de H3 mediante imágenes de inmunofluorescencia en células JAWS II tratadas con nanopartículas solubles de H3 frente a GP-H3. La débil fluorescencia de fondo en los controles de células no tratadas indicó una baja adsorción inespecífica de anticuerpos fluorescentes ( Apéndice SI , Fig. S3 A ). Las células JAWS II tratadas con H3 solubles mostraron una fluorescencia débil, lo que indica la baja internalización de la proteína H3 ( Fig.2 E). En comparación, las células tratadas con nanopartículas de GP-H3 mostraron una fuerte fluorescencia, lo que demuestra una eficacia de absorción de antígeno significativamente mejorada en las CD. Además, los resultados de las imágenes de inmunofluorescencia también confirmaron que la especificidad y la función de H3 en las nanopartículas de GP-H3 se mantuvieron bien después de cargarlas en GP. Estos resultados revelaron que las CD absorbían fácilmente nanopartículas de HA basadas en GP.
Las CD maduras producen citocinas para facilitar la activación y diferenciación de las células T y regular la inmunidad adaptativa. Evaluamos los niveles de citocinas secretadas (IL-6 y TNF-α) de células JAWS II tratadas con diferentes formulaciones de vacunas. Como se muestra en la Fig.2 F y G , H3 soluble, GP o H3 + CpG indujeron niveles de secreción de TNF-α comparables al control, mientras que las nanopartículas de GP-H3 y GP-H3 / CpG indujeron niveles significativamente más altos de secreción de TNF-α en ambas concentraciones de H3. Mientras tanto, los grupos de CpG H3 y H3 + solubles mostraron niveles de producción de IL-6 similares a los del grupo de control en las células JAWS II ( Fig. 2 H ). En comparación, el tratamiento con GP o GP-H3 mejoró significativamente la producción de IL-6 ( P<0,05). La baja secreción de TNF-α e IL-6 en el grupo CpG H3 + podría indicar la internalización limitada de la proteína soluble y CpG en las células JAWS II. Aunque el CpG soluble no influyó en la producción de citocinas, las nanopartículas de GP-H3 / CpG cargadas con CpG mostraron una mejora sustancial sobre las nanopartículas de GP-H3. Entre todos los grupos, el tratamiento con GP-H3 / CpG indujo la mayor producción de citocinas en las células JAWS II. Por lo tanto, las nanopartículas de la vacuna GP aumentaron enormemente la producción de citocinas proinflamatorias en las células JAWS II.
Estudiamos la eficacia de maduración de las células JAWS II mediante la evaluación de un marcador de maduración de DC CD86 con citometría de flujo. De acuerdo con los resultados de la secreción de citocinas, las células JAWS II tratadas con CpG H3 o H3 + solubles mostraron niveles de fondo de expresión de CD86 ( Fig. 2 I y J ). Por el contrario, los tratamientos con GP-H3 y GP-H3 / CpG mostraron una expresión de CD86 significativamente mayor ( P <0,001), como lo revela el corrimiento al rojo de los espectros de fluorescencia y la intensidad de fluorescencia media mejorada. Curiosamente, el tratamiento con nanopartículas de GP desnudo mejoró la expresión de CD86 ( P<0,05), lo que demuestra el efecto adyuvante de las nanopartículas de GP. En general, estos resultados mostraron que las nanopartículas de GP podrían internalizarse fácilmente por las CD y promover la producción de citocinas proinflamatorias, IL-6 y TNF-α, y estimular la maduración de las CD.
Inducción de respuestas inmunitarias humorales.
Investigamos la inmunogenicidad de las nanopartículas GP-H3 mediante un esquema de vacunación de dos dosis ( Fig. 3 A ). Los grupos de inmunización incluyen H3 soluble, GP-H3, GP-H3 / CpG y H3 + CpG (5 μg de H3 por ratón). Un estudio anterior mostró que una sola dosis de 10 o 20 μg de PEI era igualmente segura que las nanopartículas de holotoxina de cólera, CTB y poli (ácido láctico-coglicólico) utilizadas en dosis estándar o superiores ( 22 ). En el presente estudio, la cantidad de PEI en nanopartículas de GP fue de 1,79 μg por ratón (10 μg de GP por ratón) determinada por los resultados de TGA.
Respuestas inmunes humorales. ( A ) Cronología de la inmunización, recolección de muestras y experimentos de desafío. Los ratones BALB / c se inmunizaron dos veces en un intervalo de 4 semanas. Los grupos incluyeron mezcla soluble H3, GP-H3, GP-H3 / CpG y H3 + CpG. Se utilizaron ratones ingenuos como controles. ( B y C ) Títulos de punto final de IgG específicos de Aic en sueros de cebado y refuerzo de ratones, respectivamente. ( D y E ) HAI y títulos de neutralización en sueros de refuerzo de ratón. ( F y G ) Valores de densidad óptica (DO) a 450 nm para lavados nasales diluidos y muestras BALF para detectar IgA mucosal mediante ELISA. ( H) Valores de DO a 450 nm para muestras BALF diluidas para detectar IgG mucosal. Los datos se presentan como media ± SEM. La significancia estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey, comparando la media de cada grupo con la media del grupo H3 (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; * *** P <0,0001; ns no representa significación, P > 0,05).
Se valoraron los niveles séricos de IgG específica de antígeno ( Fig. 3 B y C ). Los resultados demostraron que el grupo H3 soluble mostró una baja eficiencia de seroconversión y un nivel bajo de IgG en suero después de la inmunización. Por el contrario, la inmunización con nanopartículas de GP-H3 indujo una seroconversión rápida y títulos de anticuerpos IgG específicos de antígeno significativamente más altos tanto en los sueros primarios ( P <0,01) como en los sueros de refuerzo ( P <0,001). H3 + CpG promovió significativamente las respuestas de IgG en suero en comparación con H3 soluble, de acuerdo con los estudios anteriores ( 25 ). Se ha demostrado en ensayos que el CpG acelera la inducción y generación de títulos de anticuerpos protectores más altos con vacunas proteicas ( 26 ⇓ -28 ). Todos los ratones vacunados con nanopartículas de GP (GP-H3 y GP-H3 / CpG) mostraron títulos altos de IgG específica de antígeno sérico después de la inmunización de refuerzo. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre GP-H3, GP-H3 / CpG y H3 + CpG en la producción de anticuerpos.
El título de inhibición de la hemaglutinación (HAI) se correlaciona con la protección inmunitaria inducida por HA. Un título de HAI sérico ≥40 se considera protector ( 29 ). Como se muestra en la Fig. 3 D , los ratones inmunizados con H3 soluble mostraron títulos de HAI relativamente bajos. Por el contrario, las nanopartículas de GP-H3 indujeron un título de HAI significativamente más alto ( P <0,0001) que el grupo H3. Aunque el grupo GP-H3 / CpG mostró títulos elevados de HAI en comparación con los grupos GP-H3 y H3 + CpG, la diferencia no es significativa.
Los anticuerpos pueden ser neutralizantes o no neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes inhiben la infectividad viral al unirse estrechamente a estructuras virales importantes y correlacionan la protección inmunológica de muchas vacunas ( 30 ). Como se muestra en la Fig.3 E , se indujeron títulos de anticuerpos de neutralización específicos del virus Aic significativamente más altos en GP-H3 ( P <0,0001), GP-H3 / CpG ( P <0,0001) y mezcla H3 + CpG ( P <0,0001) grupos en comparación con el grupo H3 soluble. H3 en nanopartículas GP indujo una actividad neutralizante comparable a la mezcla H3 + CpG ( P > 0.05), y CpG no agregó ninguna ventaja cuando se combinó en nanopartículas GP con H3 ( P> 0,05). El resultado de la neutralización de anticuerpos fue consistente con los resultados de los títulos de anticuerpos y HAI.
En la vacunación puede inducir inmunoglobulina A (IgA) e IgG de las mucosas en las superficies del tracto respiratorio, previniendo la infección por influenza en el sitio de entrada viral. La sIgA de reacción cruzada proporcionó una amplia protección contra los virus de la influenza heterólogos y heterosubtípicos ( 31 ). Como se muestra en la Fig. 3 F y G , H3 soluble indujo niveles bajos de sIgA en lavados nasales y líquido de lavado broncoalveolar (BALF). Por el contrario, los grupos de nanopartículas GP-H3 y GP-H3 / CpG mostraron niveles elevados de anticuerpos IgA, que también son más altos que los del grupo de mezcla H3 + CpG. También observamos altos niveles de IgG en BALF ( Fig.3 H) pero no en lavados nasales. Estos resultados fueron consistentes con las observaciones previas de que sIgA dominaba la respuesta de anticuerpos del tracto respiratorio superior, mientras que IgG era el principal isotipo de anticuerpo en el tracto respiratorio inferior ( 32 ). Observamos que las nanopartículas de GP-H3 y GP-H3 / CpG indujeron niveles de IgG significativamente más altos ( P <0.01, Fig.3 H ) y títulos de HAI ( P <0.001, Apéndice SI , Fig. S3 B ) en BALF que en H3 soluble, comparable al grupo de mezcla H3 + CpG, pero los títulos de HAI no se detectaron en los lavados nasales de todos los grupos ( Apéndice SI , Fig. S3 B ).
Estos resultados demostraron que las nanopartículas de GP potenciaron de forma potente las respuestas inmunitarias de los anticuerpos no solo en los compartimentos sistémicos sino también en las superficies mucosas locales. Colocar nanopartículas de CpG a GP con H3 no fortaleció más significativamente las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno, lo que indica que la nanopartícula de GP es un sistema adyuvante robusto en sí mismo y puede enmascarar el efecto adyuvante de CpG. Observamos resultados similares de nanoclusters de proteínas autoensamblados en estudios previos ( 33 ).
Inducción de respuestas inmunitarias celulares.
La inmunidad celular juega un papel crucial en la batalla contra la infección por influenza. La producción temprana de citocinas en los programas de vacunación es la dimensión y magnitud de las respuestas inmunitarias específicas de antígeno. Evaluamos las frecuencias de las células secretoras de IL-4 en los linfocitos del bazo y de los ganglios linfáticos cervicales (CLN) 3 semanas después de reforzar la inmunización. Como se muestra en la Fig. 4 A , observamos un número significativamente mayor de esplenocitos secretores de IL-4 en los grupos de nanopartículas GP-H3 ( P <0,001) y GP-H3 / CpG ( P <0,0001) en comparación con los grupos de nanopartículas solubles H3 o H3 + Grupos de mezcla CpG. No encontramos diferencias significativas entre los grupos CpG soluble H3 y H3 + en el número de esplenocitos secretores de IL-4 ( P> 0,05). De manera similar, las nanopartículas de GP impulsaron la generación de linfocitos secretores de IL-4 en CLN de ratones vacunados ( Fig. 4 B ). Mientras tanto, también se observaron linfocitos productores de IFN-γ en bazos y CLN de ratones inmunizados con nanopartículas. La inmunización con nanopartículas de GP-H3 indujo significativamente más linfocitos productores de IFN-γ que H3 soluble ( Apéndice SI , Fig. S4 A y B ). Teniendo en cuenta las abundantes células secretoras de IL-4 observadas, medimos los niveles de anticuerpos IgE en sueros de refuerzo. Los ratones vacunados con nanopartículas GP-H3 mostraron niveles bajos de IgE similares a los del grupo H3 soluble ( Apéndice SI , Fig. S4 C). Además, no se observó inflamación visible en la cavidad nasal del ratón 24 h después de la inmunización con nanopartículas de GP-H3 ( Apéndice SI , Fig. S5 A ). Tampoco encontramos cambios aparentes en el peso corporal del ratón ni infiltración de células inflamatorias en los pulmones 7 días después de la inmunización ( Apéndice SI , Fig. S5 B y C ).
Respuestas inmunitarias celulares. ( A y B ) Células secretoras de IL-4 en esplenocitos y células CLN. ( C y D ) Células plasmáticas IgG e IgA específicas de antígeno en esplenocitos. ( E y F ) Proliferación de células T CD3 + CD4 + mediante ensayo de tinción CFSE. ( G y H ) Proliferación de células T CD3 + CD8 +. La población con menor intensidad de fluorescencia de CFSE se marcó como área P, que representa las células que han sufrido proliferación. Los datos se presentan como media ± SEM. La significancia estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey, comparando la media de cada grupo con la media de un grupo de control (H3) (* P<0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001; ns no representa significación, P > 0.05).
IL-4 facilita la proliferación y diferenciación de células B en células plasmáticas secretoras de anticuerpos (ASC) ( 34 ). Estudiamos las ASC de IgG e IgA específicas de antígeno en bazos de ratón y analizamos si la frecuencia de linfocitos secretores de IL-4 se correlaciona con la inducción de anticuerpos. Como se muestra en la Fig. 4, C y D , en comparación con nanopartículas solubles de H3, GP-H3 y GP-H3 / CpG indujeron un mayor número de ASC de IgG e IgA específicas de H3 en los esplenocitos. También observamos un patrón de células B plasmáticas similar en los tejidos linfoides asociados a la nariz (NALT) ( Apéndice SI , Fig. S5 D ). Por lo tanto, las nanopartículas de GP aumentaron significativamente la generación de células B plasmáticas específicas de antígeno.
Se evaluó la proliferación de células T CD4 + y CD8 + en esplenocitos mediante el ensayo de tinción de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) ( Fig. 4 E - H y Apéndice SI , Fig. S6 ). Si bien todos los grupos de inmunización mostraron una disminución notable en la intensidad de fluorescencia de CFSE celular sobre los controles, se provocó una mayor proliferación de células T CD4 + y CD8 + en los grupos GP-H3 y GP-H3 / CpG frente al grupo H3 soluble. También analizamos los porcentajes de linfocitos T CD4 + y CD8 + en esplenocitos después de la reestimulación del antígeno ( Apéndice SI , Fig. S7). Los grupos GP-H3 y GP-H3 / CpG mostraron tasas de linfocitos T CD4 + y CD8 + más altas que el grupo H3 soluble en los esplenocitos a granel. Por lo tanto, la vacunación con nanopartículas de GP promovió significativamente la respuesta inmune celular, lo que indica la apreciable adyuvante de las nanopartículas de GP. Aunque CpG mejoró las respuestas de las células T en el contexto de la mezcla H3 + CpG, no observamos el efecto adyuvante en las nanopartículas de GP-H3 / CpG ( Fig. 4 E - H ).
Eficacia protectora contra la exposición al virus de la influenza homóloga.
Investigamos la eficacia de la profilaxis de diferentes formulaciones desafiando a los ratones con 15 veces la dosis letal media (LD 50 ) Aic ( Fig. 5 A y B ) 4 semanas después de la inmunización de refuerzo. La inmunización con H3 soluble confirió protección parcial (40% de supervivencia del ratón) con aparente pérdida de peso corporal ( Apéndice SI , Fig. S8 A ). Por el contrario, los ratones de los grupos de inmunización de mezcla GP-H3, GP-H3 / CpG y H3 + CpG sobrevivieron al desafío sin una pérdida de peso significativa. Estos resultados demostraron que las vacunas de nanopartículas GP mostraron efectos protectores superiores frente al H3 soluble.
Eficacia protectora frente a la exposición al virus de la gripe homólogo. ( A ) Morbilidad y ( B ) mortalidad de ratones después de la exposición. ( C ) Análisis de patología histológica mediante tinción H&E. La sección de pulmón de ratón no infectado se utilizó como control negativo. Las flechas rojas en las imágenes indican infiltración de leucocitos. Las imágenes son representantes de cada grupo. (Barras de escala, 200 μm.) ( D ) Gráfico de barras que muestra las puntuaciones del grado de infiltración leucocitaria. ( E ) Determinación de títulos de virus de pulmón de ratón. ( F - H) Evaluación de los niveles de citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-12 e IL-6) en BALF de ratones infectados. Los datos se presentan como media ± SEM. La significación estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunnett, comparando la media de cada grupo con la media de un grupo de control. El grupo de ratones sin tratamiento previo infectado se utilizó como grupo de control en D y E , y el grupo H3 se utilizó como grupo de control en F - H (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; * *** P <0,0001; ns no representa significación, P > 0,05).
Realizamos exámenes histológicos y determinamos los títulos de virus pulmonares 5 días después del desafío. Los ratones inmunizados con H3 solubles e ingenuos demostraron un estado inflamatorio severo con daño tisular masivo e infiltración de leucocitos ( Fig. 5 C ). Por el contrario, los ratones inmunizados con nanopartículas GP (GP-H3 y GP-H3 / CpG) y mezcla H3 + CpG mostraron un estado casi normal con una infiltración de leucocitos significativamente disminuida ( Fig. 5 C y D ). Además, los ratones inmunizados con H3 también mostraron títulos elevados de virus de pulmón (1 x 10 4,83 dosis infecciosas de cultivo de tejidos [TCID 50 ]). Por el contrario, los grupos de mezcla GP-H3, GP-H3 / CpG y H3 + CpG mostraron títulos de virus pulmonares indetectables ( Fig.5 E). Estos resultados demostraron que las respuestas inmunes inducidas por nanopartículas de GP inhibieron significativamente la replicación viral en pulmones de ratón, comparable a la mezcla H3 + CpG.
Medimos los niveles de citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-12 e IL-6) en las muestras de BALF para evaluar la inmunopatología pulmonar. Como se muestra en la Fig. 5 F - H , tanto los ratones inmunizados con H3 sin tratamiento como los solubles produjeron niveles elevados de TNF-α, IL-12 e IL-6 después de la infección por el virus. En comparación, los ratones de los grupos de mezcla GP-H3, GP-H3 / CpG y H3 + CpG mostraron niveles de TNF-α, IL-12 e IL-6 significativamente reducidos. También detectamos niveles de anticuerpos IgA e IgG específicos del virus Aic sustancialmente más altos en muestras BALF de ratones infectados en los grupos inmunizados con nanopartículas de GP ( Apéndice SI , Fig. S8 B ).
Estos resultados demostraron que las nanopartículas de GP-H3 sin un adyuvante proporcionaron una protección completa en ratones contra la infección por el virus Aic. Las nanopartículas de GP se mostraron muy prometedoras a la hora de estimular las respuestas inmunitarias de HA de la influenza y proporcionar protección contra la infección por el virus de la influenza, comparable al adyuvante modelo CpG. Las nanopartículas GP pueden ser una plataforma de vacuna potente para llevar las vacunas de proteínas recombinantes a aplicaciones clínicas cuando hay adyuvantes raros disponibles para este propósito (CpG todavía es un adyuvante de laboratorio para estudios de vacunación en la actualidad).
Eficacia protectora frente a la exposición al virus de la influenza heterólogo.
Empleamos el virus heterólogo A / Philippines / 2/1982 (Phi, H3N2) para estudiar el efecto de protección cruzada conferido por nanopartículas GP en la vacunación. Los ratones inmunizados se expusieron a 2 x LD 50 del virus Phi 4 semanas después de la inmunización de refuerzo. Como se muestra en la Fig. 6 A y B y el Apéndice SI , Fig. S9 A , todos los ratones del grupo H3 soluble sufrieron una pérdida de peso rápida y severa y murieron en los días 7 9 después del desafío, lo mismo que el grupo de control sin tratamiento previo. Los grupos de mezcla GP-H3, GP-H3 / CpG y H3 + CpG mostraron una protección completa con una ligera pérdida de peso.
Eficacia protectora frente a la exposición al virus de la gripe heterólogo. ( A ) Morbilidad y ( B ) mortalidad de ratones después de la exposición. ( C ) Títulos de punto final de IgG de protección cruzada contra el virus Phi en sueros de refuerzo de ratones. ( D y E ) Niveles de IgG e IgA específicos del virus Phi en BALF. ( F ) Niveles de IgA específicos del virus Phi en lavados nasales. ( G ) Niveles de anticuerpos específicos de hrHA3 en suero. ( H e I ) Esplenocitos secretores de IL-4 e IFN-γ bajo estimulación del virus Phi inactivado. Los datos se presentan como media ± SEM. La significancia estadística se analizó mediante ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey (* P<0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** P <0,0001; ns no representa significación, P > 0.05).
Un análisis comparativo de las secuencias de aminoácidos de Aic y Phi HA mostró una diferencia del 8,48%, lo que representa una deriva antigénica sustancial ( Apéndice SI , Tabla S1 ). Investigamos la reacción cruzada y las actividades de neutralización del suero inmune de ratones contra Phi. Como se muestra en la Fig. 6 C , las nanopartículas de GP (GP-H3, GP-H3 / CpG) y la mezcla H3 + CpG indujeron títulos de anticuerpos IgG específicos del virus Phi significativamente más altos en sueros de ratón que H3 soluble. Sin embargo, no se observaron títulos de neutralización cruzada aparentes en todos los grupos ( Apéndice SI , Fig. S9 B ). GP nanopartículas también indujo altos niveles de IgA específicos del virus de la phi en los lavados nasales y los mayores niveles de IgG e IgA en BALF ( Fig. 6 D - F). Curiosamente, los títulos de IgA mucosa de reacción cruzada inducidos por nanopartículas de GP-H3 fueron más altos que en el grupo de mezcla H3 + CpG. No se detectaron títulos de HAI con reactividad cruzada notable contra el virus Phi en sueros o BALF de todos los grupos ( Apéndice SI , Fig. S9 C ). Medimos los títulos de anticuerpos específicos de la proteína del tallo Aic HA extraído de la cabeza (hrHA3) y observamos títulos de anticuerpos significativamente más altos en los grupos de nanopartículas GP-H3 y GP-H3 / CpG que en el grupo H3 soluble ( Fig. 6 G ). Un ensayo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) que utiliza un dominio de unión al receptor de proteína espiga (RBD) del SARS-CoV-2 marcado con his irrelevante como antígeno de recubrimiento excluyó la influencia de la etiqueta his en hrHA3 ( Apéndice SI , Fig. S9 D). Las nanopartículas de GP cargadas con HA indujeron significativamente anticuerpos específicos del tallo de HA, contribuyendo a la protección heteróloga contra el virus Phi.
Evaluamos los esplenocitos secretores de citocinas. Bajo la estimulación con virus Phi inactivados, los grupos de nanopartículas GP mostraron poblaciones de esplenocitos secretores de IL-4 e IFN-γ significativamente más altas ( Fig. 6 H e I ). Por el contrario, el grupo H3 soluble mostró pocos esplenocitos de este tipo.
A continuación, estudiamos los niveles de anticuerpos de reacción cruzada en sueros inmunes y lavados de mucosas contra A / Wisconsin / 15/2009 (H3N2, Wis) y reordenado A / Shanghai / 2/2013 (H7N9, rSH) del grupo filogénico HA 2. GP- Las nanopartículas de H3 y GP-H3 / CpG indujeron anticuerpos IgG en suero significativamente más altos específicos para Wis y rSH que para H3 soluble, mientras que los niveles de anticuerpos específicos para rSH fueron mucho más bajos que los de Wis ( Apéndice SI , Figs. S10 A y S11 A ). Observamos niveles elevados de anticuerpos mucosos (IgG e IgA) específicos de Wis de los grupos de nanopartículas GP ( Apéndice SI , Fig. S10 B - D ) en contraste con los niveles bajos o indetectables de anticuerpos contra rSH ( Apéndice SI , Fig. S11 B- D ). Los resultados indicaron que las nanopartículas de GP-H3 podrían conferir una mejor protección contra las cepas heterólogas del mismo subtipo, pero una protección limitada contra los virus heterosubtípicos (como los virus del subtipo H7) incluso del mismo grupo HA.
Discusión
Se necesitan con urgencia vacunas contra la influenza de amplia protección debido a la continua deriva antigénica y el desplazamiento de los virus de la influenza. La inmunidad de la mucosa de la influenza podría conferir una amplia protección cruzada contra virus heterólogos y heterosubtípicos. En la vacunación con vacunas HA recombinantes es una estrategia segura y prometedora en la generación de inmunidad mucosa y la prevención de la infección por el virus de la influenza. Sin embargo, la eficacia de las vacunas proteicas administradas por vía intravenosa se ve desafiada por el epitelio nasal áspero y tolerogénico. Las vacunas basadas en nanopartículas tienen el potencial de superar los obstáculos asociados con la administración de vacunas.
Las nanopartículas GO son un tipo de nanomateriales en forma de hoja 2D que han demostrado atributos superiores para la administración de fármacos, incluida una superficie ultragrande, una fácil modificación y una excelente biocompatibilidad fisiológica. Generamos una nanoplataforma de vacuna contra la influenza basada en GO funcionalizando GO con PEI ramificado para la vacunación. Posteriormente, construimos nanopartículas de gripe GP en un enfoque de mezcla / adsorción simple, fácil de manipular y productivo. Esta plataforma de vacunas posee múltiples características favorables para mejorar la inmunogenicidad de las vacunas, incluida una alta capacidad de carga de antígenos, una superficie mucoadhesiva y de partículas positivas y una buena flexibilidad para varios componentes de la vacuna. Con características de mejoramiento del sistema inmunológico que se sinergizan en las mismas partículas, las vacunas de nanopartículas GP facilitan una respuesta inmune integral,
La respuesta de los anticuerpos a la influenza HA es un atributo esencial de las vacunas diseñadas para prevenir la infección por el virus de la influenza ( 32 , 35). Mejorar la magnitud y amplitud de las respuestas de anticuerpos es fundamental para desarrollar vacunas contra la influenza altamente eficientes y protectoras en general. Descubrimos que la vacunación con nanopartículas de gripe GP (GP-H3 y GP-H3 / CpG) impulsó de manera potente las respuestas de anticuerpos en sitios sistémicos y superficies mucosas. Observamos niveles de IgG específicos de antígeno, títulos de HAI y títulos de microneutralización significativamente aumentados en sueros inmunes de ratón de grupos de nanopartículas GP de influenza que en el grupo H3 soluble. También detectamos títulos de anticuerpos de reactividad cruzada sustancialmente mejorados contra los virus heterólogos Phi y Wis. Además, se indujeron anticuerpos IgG de alto nivel contra el antígeno del tallo HA conservado, lo que indica una protección más amplia. Por otro lado, el efecto "reservorio de antígeno" se descubrió en nanopartículas de GO en estudios previos (36 ). Los anticuerpos IgG de reacción cruzada en sueros de ratón pueden beneficiarse de la mejora de la sostenibilidad del antígeno necesaria para la hipermutación somática / maduración de la afinidad de las células B y el cambio de clase en los centros germinales, en particular para las regiones del tallo de HA débilmente inmunogénicas ( 37 ). Los mecanismos efectores mediados por Fc, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, podrían contribuir a la protección cruzada ( 38 , 39 ).
La inmunidad de las mucosas impulsada por IgA es uno de los principales contribuyentes a la protección del virus de la influenza. sIgA es muy eficaz para prevenir la infección por influenza en el portal de entrada del virus. Como sIgA es más reactivo que IgG ( 40 ), el sIgA inducido en grupos de nanopartículas GP también es un componente crítico del escenario protector contra varias infecciones por virus de influenza. Los anticuerpos sIgA en los lavados de la mucosa revelaron también una amplitud mejorada de unión de anticuerpos. Como resultado, la amplitud de anticuerpos mejorada confirió una mayor eficacia de protección cruzada en ratones inmunizados con nanopartículas de GP.
Las respuestas celulares juegan un papel crucial en la lucha contra las infecciones por el virus de la influenza. Las células T colaboradoras son los actores centrales en la organización de una respuesta inmunitaria eficaz. La diferenciación de linfocitos T auxiliares ingenuos en subtipos está programada por un nicho de citocinas específico. El TNF-α, como una de las citocinas proinflamatorias más críticas en la inmunidad celular, atrae la migración de células inmunes, mejorando las respuestas inmunes. IL-6 podría promover la producción de IL-4, una potente citoquina que dirige la diferenciación de Th2. Descubrimos que las nanopartículas de gripe GP aumentaron la producción de TNF-α e IL-6 en cultivos de DC JAWS II. Además, la vacunación con nanopartículas aumentó drásticamente la generación de células secretoras de IL-4 en los bazos y los ganglios linfáticos cervicales de los ratones. IL-4 puede facilitar la proliferación y diferenciación de células B en ASC. Estos resultados estaban de acuerdo con las poblaciones de ASC de IgG e IgA específicas de antígeno elevadas observadas. El IFN-γ es fundamental para modular la inmunidad celular y coordinar numerosas funciones protectoras en la infección por virus. También observamos significativamente más linfocitos productores de IFN-γ, lo que contribuyó a la protección tanto homóloga como heteróloga en la vacunación con nanopartículas de GP.
Observamos fuertes respuestas celulares por inmunización con nanopartículas GP, incluidas las respuestas de células T CD8 +. La localización de antígenos citoplasmáticos intracelulares es un requisito previo para la presentación cruzada de antígenos extracelulares a células T CD8 + por moléculas MHC I ( 41 , 42 ). Estudios anteriores revelaron que las nanopartículas basadas en GO podrían transitar específicamente a través de una vía citosólica intracelular debido a la capacidad de desestabilizar las membranas lipídicas de las vesículas intracelulares ( 43 , 44 ) o mediante la autofagia activada por GO ( 37 ). Además, está bien documentado que la PEI podría inducir un escape endosómico debido al "efecto de esponja de protones" ( 45). Estas intrigantes características fisicoquímicas de las nanopartículas de GP pueden contribuir a las respuestas de las células T CD8 y la protección heteróloga observada.
Como portadores de administración de vacunas, las nanopartículas de GP podrían administrar simultáneamente antígenos y adyuvantes. La gran área de superficie y la alta capacidad de carga de las nanopartículas de GP facilitaron la visualización de múltiples antígenos en la superficie, lo que resultó en una interacción sólida con las células inmunes a través de reconocimientos multivalentes. Además del papel de portador de administración, las nanopartículas de GP exhibieron efectos inmunoestimulantes. Demostramos que las nanopartículas de GP promovieron significativamente la internalización de antígenos en las CD, aumentaron la producción de citocinas proinflamatorias y estimularon la maduración de las CD. Observamos que las nanopartículas de GP sin antígeno mejoraron la generación de DC de IL-6 y la expresión de CD86, lo que indica un efecto inmunoestimulante inherente de las propias partículas.43 , 44 ), la activación de la vía de señalización puede contribuir parcialmente a los efectos inmunoestimulantes observados de las nanopartículas de GP. De lo contrario, el efecto adyuvante de nanopartículas de GP merece ser estudiado en el futuro.
CpG ODN es un potente inmunomodulador mucoso reconocido. A pesar de la excelente capacidad adyuvante, el CpG no ha sido aprobado para uso humano debido a problemas de seguridad, como la activación de las células B autorreactivas y el aumento del riesgo de enfermedad autoinmune ( 46 ) y la magnitud variable de los efectos inmunitarios en los ensayos clínicos ( 28 ). En ausencia de cualquier adyuvante adicional, la nanopartícula GP potenció significativamente las respuestas inmunes específicas de antígeno, lo que confiere una protección completa en ratones contra la infección por influenza, comparable al papel de CpG en la mezcla H3 + CpG. Las nanopartículas de GP pueden funcionar como una plataforma de vacuna con adyuvante automático. El fuerte efecto autoadyuvante de las nanopartículas de GP enmascara el papel de CpG coincorporado.
Como biomaterial emergente, los perfiles de seguridad, incluida la acumulación y el aclaramiento a largo plazo de las nanopartículas de GP, necesitan una evaluación preclínica sistemática adicional. Estudios anteriores indicaron que las nanopartículas de GO podrían degradarse en presencia de peroxidasa humana ( 14 ). Las nanoláminas de GO-PVP inyectadas por vía intravenosa se excretaron en la orina y se aclararon en los órganos intrarregionales ( 47 ). Sin embargo, algunos otros estudios demostraron que las nanopartículas de GO se retuvieron en el cuerpo durante 4 semanas después de múltiples inyecciones intraperitoneales con una dosis alta (4 mg de nanopartículas / kg de peso corporal) en ratas o ratones Wistar ( 15 , 48).), a pesar de que no se han encontrado efectos tóxicos sobre los parámetros sanguíneos y la salud y el crecimiento de los animales. También se ha demostrado que los nanomateriales de carbono inducen una patogenicidad similar al amianto ( 49 ). Por lo tanto, en la actualidad sigue siendo una pregunta si las nanopartículas de GP persistirían en los pulmones de manera indefinida. A pesar de que no se observaron efectos adversos aparentes en nuestro sencillo estudio de seguridad, se necesita una evaluación más completa antes de futuros ensayos clínicos. No obstante, nuestro estudio ofrece información sobre el desarrollo de sistemas de vacunas de alto rendimiento con nanopartículas en forma de hoja 2D.
En resumen, generamos nanopartículas de influenza HA / GP de alto rendimiento en la vacunación contra la influenza. La nanopartícula GP funcionalizada sirvió como un sistema de administración / adyuvante robusto, mejorando significativamente la inmunogenicidad de HA recombinante. La inmunización con nanopartículas de gripe GP aumentó significativamente la magnitud y la amplitud de las respuestas inmunitarias, lo que confiere protección tanto homogénea como heteróloga. La nanopartícula GP mostró un enorme potencial como candidata para su desarrollo en vacunas. Con una gran versatilidad y flexibilidad, las nanopartículas GP podrían adaptarse fácilmente para construir vacunas mucosas para diferentes patógenos infecciosos respiratorios.
Materiales y métodos
Diseño experimental.
El objetivo de este estudio fue desarrollar una generación de influenza segura, eficiente e independiente del virus en vacunas que inducen protección cruzada. Con este fin, desarrollamos vacunas de nanopartículas de HA contra la influenza recombinantes basadas en GO. Para validar los efectos de mejora inmunológica de estas vacunas, estudiamos su interacción con las CD de JAWS II. Además, evaluamos las respuestas inmunitarias y la protección de la profilaxis contra cepas de influenza homólogas y heterólogas en ratones después de la inmunización con estas nanopartículas. El número de ratones por grupo experimental se indica en el método. Se realizaron análisis estadísticos cuando fue aplicable y se incluyeron en las leyendas de las figuras. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Estatal de Georgia.
Materiales.
El polvo de GO, la PEI ramificada con un peso molecular medio de 60 kDa y el hidrocloruro de N - (3-dimetilaminopropil- N -etilcarbodiimida) (EDC) se adquirieron de Sigma-Aldrich. CpG ODN1826 se compró a InvivoGen. CFSE y BS3 se compraron a Invitrogen.
Líneas celulares y virus.
Spodoptera frugiperda (Sf9, American Type Culture Collection (ATCC), CRL-1711) células de insectos, DC murinas JAWS II (ATCC CRL-11904) y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK (NBL-2), ATCC CCL-34 ) se cultivaron en las condiciones recomendadas por el proveedor.
Los virus de la influenza Aic, Phi, Wis y rSH se expandieron en huevos de gallina embrionados. Se prepararon Aic y Phi adaptados a ratones como homogeneizados de pulmón de ratones infectados. El LD 50 se determinó mediante el método de Reed y Muench.
Expresión, purificación y caracterización de HA trimérico recombinante.
Aic HA (H3) estabilizado con GCN4 se expresó en células Sf9 mediante un sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) y se purificó mediante un método de afinidad His-tag utilizando resinas Ni-NTA, como se describió anteriormente ( 24 ). Se realizó SDS-PAGE seguida de tinción con azul de Coomassie (Bio-Rad) y se realizaron transferencias Western usando anticuerpos anti-Aic HA para verificar la H3 purificada. La concentración de H3 se determinó mediante un kit de ensayo de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific). La trimerización de HA se determinó mediante reticulación de BS3 a diferentes concentraciones (0, 0,5, 5 y 10 mM) seguido de transferencias Western como se describió previamente ( 50 ).
Preparación de nanopartículas GO y GP.
Las nanopartículas de GO se prepararon a partir de polvo de GO mediante ultrasonidos en la punta. Brevemente, el polvo de GO se resuspendió en agua Milli-Q y luego se sonicó a 100 W en un baño de hielo durante 2 h. El tamaño de partícula de GO se midió a diferentes intervalos de tiempo de sonicación mediante dispersión de luz dinámica (DLS) con un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). La solución final de GO se centrifugó a 6.000 rpm durante 5 min para eliminar las partículas más grandes.
Preparamos nanopartículas de GP mediante el método de acoplamiento de carbodiimida. Se sometieron a ultrasonidos diez mililitros de solución de GO (0,5 mg / ml) durante 30 min, y luego se añadieron 0,6 ml de solución de PEI (50 mg / ml) y se sonicaron durante otros 30 min. La mezcla se activó añadiendo dos lotes de EDC (50 mg) en un intervalo de 30 minutos seguido de agitación a temperatura ambiente durante la noche. Las nanopartículas de GP se recogieron mediante centrifugación a 15.000 rpm a 4 ° C durante 2 hy luego se lavaron repetidamente con agua Milli-Q para eliminar la PEI libre. Los gránulos de nanopartículas GP se resuspendieron en agua pura y se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad para su uso posterior. Las concentraciones de nanopartículas de GO y GP se determinaron por sus absorbancias a 230 nm con un espectrómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific), según la ley de Beer-Lambert (A = εlc). Aquí en,−1 ⋅ cm −1 , como se informó anteriormente ( 18 ).
Fabricación y optimización de nanopartículas GP-H3 y GP-H3 / CpG.
Las formulaciones de vacunas basadas en GP se prepararon mediante un método simple de mezcla / adsorción. La capacidad de carga de H3 en las nanopartículas de GP se evaluó mediante la reducción de SDS-PAGE. Preparamos una serie de nanopartículas de GP-H3 en seis proporciones de peso diferentes (2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 6 y 1: 8) con agitación durante 20 min a temperatura ambiente. Las nanopartículas de GP-H3 se recogieron mediante centrifugación a 15.000 rpm durante 20 min y luego se dispersaron en una cantidad igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los sobrenadantes se mantuvieron por separado. Tanto las nanopartículas como los sobrenadantes de todas las formulaciones se analizaron mediante SDS-PAGE al 10%. El gel se tiñó con azul de Coomassie y se obtuvieron imágenes con el sistema de imágenes ChemiDoc Touch (Bio-Rad).
En algunas formulaciones, CpG se colocó sobre nanopartículas de GP con antígenos. Empleamos electroforesis en gel de agarosa para investigar si todos los CpG de alimentación formaban complejos y se cargaban en las nanopartículas de GP. La mezcla de CpG soluble, GP-H3 / CpG (10: 5: 1), GP-H3 / CpG (10: 5: 2.5) y H3 + CpG se centrifugaron a 15.000 rpm durante 20 min y los sobrenadantes se analizaron por 1 % electroforesis en gel de agarosa. El gel se visualizó con el sistema de imágenes ChemiDoc Touch (Bio-Rad) para determinar la existencia de CpG en los sobrenadantes.
Caracterización de nanopartículas.
Los tamaños de partícula y los potenciales Zeta de las nanopartículas resultantes se midieron mediante DLS. La morfología de las nanopartículas GO se caracterizó por AFM con un Bruker Icon AFM y TEM con un JEOL 100 CX-II. Los espectros de absorción de UV-Vis de las muestras se registraron mediante un espectrómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). La TGA de las nanopartículas GO y GP se realizó usando un instrumento TA Q500 bajo una atmósfera de nitrógeno inerte. La velocidad de calentamiento y la velocidad de flujo de nitrógeno fueron 10 ° C / min y 50 ml / min, respectivamente. La temperatura máxima fue de 600 ° C.
Captación celular en células JAWS II mediante imágenes de inmunofluorescencia.
Los perfiles de internalización de nanopartículas solubles H3 y GP-H3 en células JAWS II se estudiaron mediante imágenes de inmunofluorescencia. Las células JAWS II se sembraron a 2 x 10 5 células / pocillo (2 x 10 5células / mL, 1 mL) en una placa de cultivo celular de 24 pocillos y tratada con nanopartículas solubles de H3 o GP-H3 a una concentración de H3 de 10 μg / mL. Las células no tratadas se utilizaron como controles negativos. Después de 16 h de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS de Dulbecco y luego se fijaron y se permeabilizaron con tampón de fijación / permeabilización de BD a 4 ° C durante 20 min, seguido de bloqueo con albúmina de suero bovino al 5% durante 1 ha temperatura ambiente. Después de lavar dos veces más, las células se tiñeron sucesivamente con anticuerpos específicos de antígeno durante 1 hora y anticuerpos IgG anti-ratón de cabra conjugados con DyLight 649 fluorescentes (BioLegend) durante 30 minutos. Las células se registraron utilizando un microscopio de fluorescencia Keyence BZ-X710.
Perfiles de citocinas proinflamatorias y maduración de células JAWS II estimuladas.
Células JAWS II se sembraron a 4 x 10 4 células / pocillo (4 × 10 5 células / ml, 100? L / pocillo) en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, seguido de tratamiento con soluble H3, GP, GP-H3, GP -H3 / CpG, o formulaciones de mezcla de H3 + CpG durante 16 h. La concentración final de H3 fue de 5 o 10 μg / mL. La relación de GP: H3: CpG fue 10: 5: 1 (p: p: p). Las células no tratadas se utilizaron como controles negativos. Se recogieron los sobrenadantes para determinar los niveles de IL-6 y TNF-α utilizando kits de ELISA de citocinas (Thermo Scientific). Se recogieron células para evaluar la maduración de las células JAWS II estimuladas. El marcador de superficie celular CD86 se determinó mediante citometría de flujo, como se describió previamente ( 51 ). Los datos se analizaron con el software FlowJo.
Inmunización, recolección de muestras y desafío.
Se inmunizaron ratones hembra BALB / c (6 ∼ 8 semanas de edad, n = 20) con 30 μL de H3 soluble, GP-H3, GP-H3 / CpG o H3 + CpG en solución salina (5 μg de proteína H3 por ratón). Los ratones se vacunaron dos veces en un intervalo de 4 semanas.
Se recogieron los sueros primarios 3 semanas después de la inmunización de refuerzo, y los sueros de refuerzo se recogieron 3 semanas después de la inmunización de refuerzo ( n = 7). Se recogieron lavados nasales y BALF ( n = 3 a 4) 3 semanas después de reforzar la inmunización lavando las respectivas cavidades con 1 ml de PBS estéril frío y luego se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 min. Los bazos, CLN y NALT de los ratones inmunizados ( n = 4) se aislaron 3 semanas después de la inmunización de refuerzo . Las suspensiones unicelulares se obtuvieron triturando suavemente los tejidos con portaobjetos de microscopio esmerilados. Los esplenocitos se recolectaron después de tratarlos con tampón de lisis de glóbulos rojos.
Los ratones ( n = 5) fueron desafiados con 15 × LD 50 de Aic adaptado al ratón o 2 × LD 50 de Phi en 30 μL de solución salina 4 semanas después de la inmunización de refuerzo. La pérdida de peso corporal del ratón y las tasas de supervivencia se registraron diariamente durante 2 semanas después de la infección. Se utilizó una pérdida de peso superior al 20% como criterio de valoración humanitario. Se sacrificaron los ratones y se aislaron tejidos pulmonares para la determinación del título viral pulmonar y el análisis histológico 5 días después de la infección con Aic.
Evaluación de la seguridad de las nanopartículas GP-H3.
Se controló el peso corporal del ratón durante 7 días después de la vacunación. El examen histológico de la mucosa nasal del ratón y los tejidos pulmonares se realizó con tinción con hematoxilina y eosina (H&E) 24 horas y 7 días después de la vacunación, respectivamente. Las cavidades nasales se descalcificaron con solución de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético, seguido de criosección y tinción con H&E. Los tejidos pulmonares se incrustaron en parafina, seguido de corte y tinción con H&E.
ELISA de anticuerpos, ensayo HAI y ensayo de neutralización viral.
El ELISA de anticuerpos se realizó como se describió previamente ( 52 ). Se analizaron los títulos de punto final de los anticuerpos de virus (Aic, Phi, Wis o rSH) o IgG, IgA o IgE específicos de H3 en sueros, lavados nasales o muestras de BALF después de la inmunización. La dilución más alta con una DO 450 dos veces la del grupo ingenuo fue utilizado como el título de punto final. Los títulos de HAI de sueros inmunes de refuerzo de ratón se determinaron como se describió previamente ( 53 ). Las muestras de suero se pretrataron con enzima destructora de receptores (Denka Seiken Co., Ltd) durante la noche a 37 ° C y luego se inactivaron por calor a 56 ° C durante 30 minutos antes de la prueba. Se usaron glóbulos rojos de pavo (0,5%) para este ensayo, y la dilución más alta capaz de inhibir la hemaglutinación del virus se usó como título de HAI.
La TCID mediana 50 de los virus de AIC y Phi se determinó según el método de Reed y Muench. Se mezclaron diluciones seriadas dobles de sueros inmunes de refuerzo de ratón inactivados por calor (56 ° C durante 30 min) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (50 μL) con 100 veces TCID 50 de virus Aic o Phi en EMEM (50 μL) durante 2 ha 37ºC. Después de la incubación, se añadió la mezcla a monocapas de células MDCK (100 así, 1,5 × 10 / ly 5 células / ml, con 2 g / ml de TBCK-tripsina) y se incubaron durante 3 d a 37 ° C. Se utilizó un ensayo de hemaglutinación estándar para determinar la inhibición del virus.
Ensayo de inmunospot ligado a enzimas.
Se realizó el ensayo de inmunospot ligado a enzimas de citocinas (ELISpot) (BioLegend) para analizar las células secretoras de IL-4 o IFN-γ. Brevemente, se sembraron esplenocitos o células CLN (3 × 10 6 células / mL, 100 μL / pocillo) en placas de filtración de 96 pocillos (MultiScreen-HA, Millipore) que fueron pretratadas con anticuerpos anti-IFN-γ o IL-4 de ratón. y luego estimulado con H3 (4 μg / mL) durante 24 ha 37 ° C. Después de retirar las células, las placas se incubaron con anticuerpo de detección de IFN-γ o IL-4 conjugado con biotina a 37 ° C durante 1 h, seguido de la adición de peroxidasa de rábano picante (HRP) -estreptavidina durante otra 1 h. Se utilizó el sustrato True Blue Peroxidase (KPL) para desarrollar manchas, y las manchas se registraron con Bioreader-6000-E (BIOSYS).
Se utilizó el ensayo ELISpot de células B para evaluar las ASC específicas de antígeno. Brevemente, las placas de filtración de 96 pocillos se recubrieron previamente con proteínas H3 (50 μL / pocillo, 4 μg / mL) durante la noche a 4 ° C, se lavaron, se bloquearon y luego se realizaron esplenocitos o células NALT (3 × 10 6 células / mL, 100 μL / pocillo) se sembraron y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Después de eliminar las células, se añadieron anticuerpos IgG o IgA anti-ratón conjugados con HRP durante 1 ha temperatura ambiente. Se utilizó el sustrato True Blue Peroxidase para desarrollar manchas. Los resultados se registraron con Bioreader-6000-E.
Ensayo de proliferación mediante tinción CFSE.
La capacidad de proliferación de los esplenocitos se evaluó utilizando el kit de ensayo de proliferación celular CFSE (Invitrogen). Los esplenocitos se tiñeron con CFSE a 37 ° C durante 10 min, se lavaron con medio completo 1640 del Roswell Park Memorial Institute a fondo y luego se sembraron en placas de 24 pocillos (1 x 10 6 células / pocillo) y se incubaron con H3 (5 μg / mL ) durante 60 h. A continuación, las células se recogieron y se tiñeron durante 30 min a 4ºC con anticuerpos anti-PE-Cy7-anti-CD4 y PE-Cy5-anti-CD8α de ratón (Biolegend) en presencia de bloqueador Fc. Después de lavar y resuspender en tampón de tinción de citometría de flujo (PBS + suero de ternero fetal al 5%), las células se midieron con un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD biosciences). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (FlowJo LLC). Los esplenocitos de ratones no tratados previamente se utilizaron como control.
Análisis de subpoblaciones de células T.
Las subpoblaciones de células T CD3 + CD4 + y CD3 + CD8 + en bazos de ratones inmunizados se analizaron mediante citometría de flujo. Brevemente, se sembraron suspensiones de esplenocitos (1 x 10 6 células / mL, 1 mL / pocillo) en placas de 24 pocillos y se reestimularon con H3 (5 μg / mL) durante 36 ha 37 ° C. Las células se recolectaron y se tiñeron durante 30 min a 4ºC con anticuerpos PE-anti-CD3ε, PE-Cy7-anti-CD4 y PE-Cy5-anti-CD8α. Después de lavar y resuspender en tampón de tinción de citometría de flujo, las células se detectaron con un citómetro de flujo BD LSRFortessa y se analizaron con el software FlowJo.
Análisis histológico tras la infección por virus.
El día 5 después de la infección con el virus Aic, los ratones se sacrificaron. Los tejidos pulmonares se aislaron, se fijaron con formalina tamponada neutra al 10% durante la noche a 4ºC, se deshidrataron y luego se incrustaron en parafina, seguido de corte y tinción con H&E. Las secciones de tejido fueron registradas por un microscopio Keyence BZ-X710 y examinadas por cinco patólogos imparciales. El grado de infiltración de leucocitos se puntuó en una escala de 0 a 5. Las puntuaciones se dieron como ausente (0), sutil (1), leve (2), moderado (3), grave (4) y masivo (5).
Titulación viral pulmonar.
Los tejidos pulmonares se homogeneizaron y los sobrenadantes se aclararon mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min a 4ºC 5 días después de la infección con el virus Aic. El 10 veces diluciones seriadas de los sobrenadantes de los pulmones (100 l) se añadieron a las placas de 96 pocillos preparados que contienen células MDCK (1,5 × 10 5 células / ml, 100 l) y se cocultivaron durante 5 d. Se llevó a cabo un ensayo de hemaglutinación estándar para determinar los títulos virales en los sobrenadantes mediante el método Reed-Munchen.
Evaluación de los niveles de citocinas inflamatorias en BALF.
Para evaluar la inmunopatología pulmonar causada por una infección por virus, se midieron los niveles de citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-12 e IL-6) en el BALF de ratones infectados de acuerdo con las instrucciones del kit ELISA de citocinas (Thermo Scientific).
Análisis estadístico.
Todos los datos se representaron como medias con el SEM. La significación estadística se analizó mediante el ANOVA de una vía. Un valor de probabilidad ( P ) de menos de 0,05 se considera estadísticamente significativo. El análisis estadístico de la tasa de supervivencia se realizó con la prueba Log-rank (Mantel-Cox). El análisis se realizó con el programa GraphPad Prism 8 (software GraphPad).
Disponibilidad de datos
Todos los datos del estudio se incluyen en el artículo y / o en el Apéndice SI .
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas / NIH de EE. UU. Bajo las subvenciones R01AI101047, R01AI116835 y R01AI143844 a B.-ZW El estudio de microscopía electrónica se realizó en parte en el Instituto de Tecnología de Electrónica y Nanotecnología de Georgia, miembro de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología apoyada por la NSF (Beca ECCS-1542174). El contenido de este estudio es de nuestra exclusiva responsabilidad y no necesariamente representa las opiniones oficiales de los patrocinadores.
Notas al pie
- ↵ 1 A quién puede dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: bwang23@gsu.edu .
Contribuciones de los autores: investigación diseñada por CD y B.-ZW; CD, YW, GXG, YM, YS y SW realizaron investigaciones; CD, YW, YM, YS, SW, S.-MK y B.-ZW aportaron nuevos reactivos / herramientas analíticas; Datos analizados de CD, YW, GXG, S.-MK, RWC y B.-ZW; CD y B.-ZW escribieron el artículo; y CD, YW, GXG, YM, YS, SW, S.-MK, RWC y B.-ZW revisaron el documento.
Los autores declaran no tener intereses en competencia.
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